0 引言 Introduction

二酰基甘油激酶(diacylglycerol kinase，DGK) 是可催化二酰基甘油(diacylglycerol，DAG)磷酸化为磷脂酸的酶家族[1]。KAWAGUCHI 等[2]发现DGKζ 是人黑色素细胞中表达最丰富的DGK 亚型，且可增加体外培养的人黑素细胞的黑色素含量，但其作用机制尚未明了。PKCβ Ⅱ是蛋白激酶Cβ(protein kinase Cβ，PKCβ)的主要剪接变体，正常皮肤中的黑素细胞表达高水平的PKCβ，其中PKCβ Ⅱ可磷酸化酪氨酸酶(即哺乳动物黑色素细胞中黑素生物合成过程中的限速酶)，参与黑色素的生成过程[3-4]。OLENCHOCK 等[5]的研究表明，DGKζ-/-细胞表现出PKCβ Ⅱ向膜的募集受损。由此推测，在黑色素细胞中，DGKζ 可能部分地通过调节PKCβ Ⅱ参与酪氨酸酶活性的调节，从而在毛色形成中起到一定作用，但至今未曾有DGKζ 参与毛色形成的相关报道，因此该研究通过Real-time PCR、Western blotting和免疫组织化学技术，检测白、灰、黑色小鼠背部皮肤中DGKζ、PKCβ Ⅱ的表达差异和定位，探讨DGKζ、PKCβ Ⅱ与毛色形成是否具有相关性。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 对比观察动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2018 年6 月至2019 年9 月在山西医科大学基础医学院组织胚胎学教研室实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 随机挑选2 月龄健康C57BL/6J 雄鼠(黑色小鼠)、ICR 雄鼠(白色小鼠)各6 只，由山西医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK(晋)2015-0001；灰色雄鼠[由2 月龄白色雌性小鼠(ICR)和黑色雄性小鼠(C57BL/6J)交配繁育得到]6 只由山西医科大学基础医学院组织胚胎学教研室实验室提供。

1.3.2 实验用主要试剂 Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒(6210A)、荧光定量PCR 试剂(RR820Q)[宝生物工程(大连)有限公司]；羊抗DGKζ 多克隆抗体(1 ∶50)、小鼠抗PKCβ Ⅱ单克隆抗体(1 ∶100)、小鼠抗磷酸化PKCβ Ⅱ(phosphated PKCβ Ⅱ，p-PKCβ Ⅱ)单克隆抗体(1 ∶100)、羊抗DGKζ 多克隆抗体(1：150)、小鼠抗p-PKCβ Ⅱ单克隆抗体(1 ∶100)[圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司]；HRP 标记的兔抗山羊IgG(1 ∶2 000)、HRP 标记的山羊抗小鼠IgG(1 ∶5 000)、超敏ECL 化学发光试剂盒(AR1170)、生物素化的兔抗山羊IgG(即用型)、生物素化山羊抗小鼠IgG(即用型)(博士德生物工程有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠背部皮肤组织处理 将小鼠麻醉后固定，于每只小鼠背部取4 块1 cm×1 cm 左右大小的皮肤组织，用生理盐水去除血液，取其中2 块分别用于提取总RNA 和蛋白质，另2 块延展在滤纸上固定好，放入新鲜配置的甲醇∶丙酮∶水(2 ∶2 ∶1)固定液中，室温固定24 h。

1.4.2 Real-time PCR 检 测DGKζ、PKCβ ⅡmRNA 表 达 从 液氮中取出保存的皮肤组织样本，用提前一天-80 ℃存放的研钵将组织研成细小粉末状，加入Trizol 试剂充分混匀，按照Trizol 试剂说明书进行总RNA 的提取和提纯，之后行1%琼脂糖凝胶电泳实验检测提取样本的RNA 质量，即用UV/visible spectrophotometer 仪器检测样本的A260和A280值(A260/A280在2.0 左右说明提取的RNA 纯度高)。依照Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明书进行反转录操作，完成后将样本置于-20 ℃保存备用。

在NCBI 中查到DGKζ、PKCβ Ⅱ、β-actin 的基因序列，在NCBI 网站中进行在线BLAST 比对确认后，使用Primer premier 5 软件分析设计引物，由北京华大基因公司进行合成，上下游引物序列见表1。

表1 ｜Real-time PCR 所用的引物序列Table 1 ｜The primer sequences of genes for real-time PCR基因名 正向引物 反向引物 长度(bp)DGKζ(Gene ID: ) 5’-TGC CCC AAG GTG AAG AAC TG-3’5’-CGG ACC ACT TCC TTA CTG CC-3’157 PKCβ Ⅱ(Gene ID: ) 5’-ATG TGG CGT ATC CCA AGT CC-3’5’-CGC TTG TCT CTA GCT TTT GGT-3’205 β-actin(Gene ID: ) 5’-GTG CTA TGT TGC TCT AGA CTT CG-3’5’-ATG CCA CAG GAT TCC ATA CC-3’174

使用荧光定量PCR 试剂，按说明书配置反应体系，放入设定好反应条件的Step One Plus 仪器中，将β-actin 作为校准内参，其中各反应阶段温度和时间设定分别为：95 ℃预变性阶段30 s，95 ℃变性阶段 5 s，64 ℃退火阶段 30 s ，72 ℃延伸阶段20 s，共40 个循环。根据数据采集结果中的Ct 值，应用2-??Ct法计算基因相对表达量，实验重复3 次。

1.4.3 Western blotting 检 测DGKζ、PKCβ Ⅱ和p-PKCβ Ⅱ在小鼠背部皮肤中的表达 从液氮中取出皮肤样本，提取蛋白质，依照Western blotting 检测方法进行实验[6]。所使用一抗为；羊抗DGKζ 多克隆抗体(1 ∶50)、小鼠抗PKCβ Ⅱ单克隆抗体(1 ∶100)、小鼠抗磷酸化PKCβ Ⅱ(phosphated PKCβ Ⅱ，p-PKCβ Ⅱ)单克隆抗体(1 ∶100)；所使用二抗为：HRP 标记的兔抗山羊IgG(1 ∶2 000)、HRP 标记的山羊抗小鼠IgG(1 ∶5 000)。使用超敏ECL 化学发光试剂盒(AR1170)进行处理，在暗室用全自动多色荧光及化学发光凝胶成像系统曝光，采集照片，根据Marker 条带确定目的蛋白条带的位置，用Image 分析软件分析，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度比值为目的蛋白相对表达量水平。

文章来源：《皮肤病与性病》 网址: http://www.pfbyxb.cn/qikandaodu/2021/0304/736.html